O jego działalności misyjnej i kaznodziejskiej wspominają Ewangelie i żydowski historyk Józef Flawiusz.

Według Ewangelii Łukasza, Jan Chrzciciel urodził się pół roku przed Jezusem z Nazaretu w „mieście w Judzie”, przez późniejszą tradycję zidentyfikowanym z wioską Ain Karim. Był synem żydowskiego kapłana Zachariasza i Elżbiety, która była krewną Marii z Nazaretu. Jego narodziny zapowiedziane były jako dowód prawdziwości zapowiedzi przez Archanioła Gabriela Marii w czasie zwiastowania, a także przepowiedziane były jego ojcu przez anioła w Świątyni Jerozolimskiej.

W dość młodym wieku Jan, zapewne po śmierci podeszłych wiekiem rodziców, zrezygnował z możliwości zostania kapłanem i rozpoczął życie pustelnika na Pustyni Judzkiej, gdzie prawdopodobnie zetknął się z esseńczykami. Na pustyni został powołany na proroka, a jego głównym zadaniem stało się wzywanie ludzi do nawrócenia oraz przygotowanie drogi do publicznej służby Mesjasza. Głosił potrzebę nawrócenia wewnętrznego i odnowy duchowej ludzi. Symbolem tego przygotowania był chrzest udzielany przez proroka słuchaczom jego nauk w rzece Jordan.

Według dwóch Ewangelii Synoptycznych, to właśnie Jan miał ochrzcić Jezusa. Ewangelia Łukasza nie mówi jednoznacznie, że to właśnie Jan ochrzcił Jezusa. Choć mówi o tym, że Jezus został ochrzczony w czasie, kiedy cały lud przystępował do chrztu, to we wcześniejszych wersetach stwierdza, że Jan został uwięziony przez Heroda. Natomiast Ewangelia Jana nie informuje w ogóle, czy Jezus był ochrzczony, stwierdza tylko, że Jan dał dwa świadectwa tego, że to Jezus jest Mesjaszem.

Niedługo po spotkaniu i ochrzczeniu Jezusa Jan został wtrącony do więzienia za jawne krytykowanie niemoralnego małżeństwa tetrarchy Galilei, Heroda Antypasa. Na skutek spisku żony Heroda, Herodiady, Jan został ścięty ok. 32 roku.

Dokładna data śmierci Jana Chrzciciela nie jest znana. Badacze datują moment śmierci proroka na koniec lat dwudziestych I wieku n.e. albo okres między 34. a 36. rokiem.

Przez chrześcijan jest uznawany za ostatniego biblijnego proroka przed nadejściem Chrystusa.

Cześć oddawana Janowi w chrześcijaństwie czerpie w dużej mierze z postawy samego Jezusa. W Ewangelii św. Mateusza Jezus określił Jana jako swego poprzednika i największego człowieka, który kiedykolwiek narodził się na ziemi.

Wspomnienie św. Jana Chrzciciela w Kościele katolickim obchodzone jest dwukrotnie:

24 czerwca – Narodzenie św. Jana Chrzciciela (uroczystość liturgiczna)

29 sierpnia – Męczeństwo św. Jana Chrzciciela (wspomnienie obowiązkowe).